Divulgació

16 de Març de 2020

Redacció Meritxell Ventura-García

La PCR, l’eina que va revolucionar la genètica

La reacció en cadena de la polimerasa, també anomenada PCR (de l’anglès, Polimerase Chain Reaction), és una tècnica d’amplificació enzimàtica in vitro que permet obtenir un gran número de còpies d’una seqüència d’ADN específica a partir de poc material biològic. És la tècnica que, històricament, més ha fet avançar el camp de la genètica i la biologia molecular, i tant és així que podem parlar de dues èpoques: abans de la PCR i després de la PCR.

L’any 1983, Kary Mullis, un bioquímic nord-americà que treballava en la síntesi de cadenes d’ADN en una empresa biotecnològica a Califòrnia, va ser qui, segons el seu propi relat, va concebre la idea de la tècnica de la PCR durant un viatge en cotxe per les muntanyes de la zona. Anys més tard (1993), i quan ja havia posat en pràctica la seva idea, va rebre el Premi Nobel de Química i el Premi Japó per la invenció d’aquesta tècnica, la qual des de llavors ha esdevingut àmpliament utilitzada als laboratoris de genètica i biologia molecular.

És la tècnica que, històricament, més ha fet avançar el camp de la genètica i la biologia molecular, i tant és així que podem parlar de dues èpoques: abans de la PCR i després de la PCR.

Quan es rep una mostra al laboratori, el primer pas després de registrar-la, identificar-la i fer totes les gestions relacionades amb el procés de recepció de mostres, és extreure’n l’ADN. A la fase d’extracció, s’obtenen quantitats molt petites d’ADN amb les que difícilment es podrien fer anàlisis gaire concloents, pel que és necessari dur a terme una PCR. Aquest mètode ens permet amplificar el fragment d’ADN que ens interessa estudiar, obtenint-ne quantitats infinitament superiors als corresponents a la mostra original, ja sigui de sang perifèrica, teixit, moll de l’ós, saliva, etc. A l’hora de preparar les mostres d’una PCR cal seguir una sèrie de protocols que indiquen l’ordre i la quantitat dels diferents reactius que cal afegir en el tub on es durà a terme la reacció. A continuació es descriuen els diferents components:

ADN motlle

Per dur a terme una PCR, i com ja s’ha comentat anteriorment, cal aïllar prèviament l’ADN de la mostra biològica d’interès. En funció de les condicions de la mostra, s’obtindrà més o menys quantitat d’ADN i aquest podrà ser de millor o pitjor qualitat. En el cas de la genètica forense, per exemple, l’ADN extret sovint es troba degradat (la mostra pot haver estat exposada a les inclemències del temps o a condicions poc òptimes per a la seva conservació), mentre que en el diagnòstic rutinari s’utilitzen mostres de teixits frescos com poden ser la sang o la saliva a partir de les quals, normalment, s’obtenen bones quantitats i qualitats d’ADN. De forma general, i perquè la reacció sigui exitosa, es recomana utilitzar entre 10 i 200 ng d’ADN, és a dir, entre 0,00000001 i 0,0000002 grams.

Encebadors

Els encebadors o primers (en anglès) són seqüències curtes d’ADN de cadena simple d’entre 20 i 40 nucleòtids que es dissenyen en funció de la seqüència d’ADN d’interès. Són específics per cada reacció i s’utilitzen de dos en dos, per determinar i definir cadascun dels extrems del fragment que interessa amplificar. Fer un bon disseny dels encebadors és clau per a la bona especificitat de la PCR, ja que són els que fan que es dupliqui un fragment concret i no pas un altre. Per dissenyar els encebadors cal seguir una sèrie d’indicacions o utilitzar programes informàtics destinats a tal efecte.

Nucleòtids

Els nucleòtids són molècules químiques orgàniques que s’enganxen entre elles de forma lineal per formar una cadena llarga. L’ADN està format per 4 nucleòtids diferents: l’adenina, la guanina, la citosina i la timina, i s’afegeixen a la reacció per tal de construir la nova cadena d’ADN. Tots quatre han d’estar presents en la mateixa concentració per evitar errors durant l’amplificació de l’ADN.

ADN polimerasa

L’ADN polimerasa és l’enzim que s’encarrega de copiar la seqüència motlle per crear-ne una de nova, incorporant nous nucleòtids a partir de l’encebador. Un dels enzims més utilitzats és la Taq polimerasa, anomenat així perquè es va aïllar per primera vegada del Thermus aquaticus, un bacteri que viu a temperatures extremes als guèisers i fonts d’aigües calentes. Cada cadena d’ADN té dos extrems, anomenats extrem 3’ i extrem 5’. L’ADN polimerasa sempre incorpora nucleòtids a partir de l’extrem 3’.

Tampó

Els tampons proporcionen a l’ADN polimerasa les condicions òptimes de pH per poder treballar. Cada ADN polimerasa necessita un tampó específic.

Clorur de magnesi, MgCl2

El clorur de magnesi es necessari per tal que la PCR sigui específica i per obtenir un bon rendiment de la reacció. Concretament, el ions de magnesi s’uneixen a l’ADN polimerasa i funcionen com a cofactor, és a dir, permeten iniciar l’activitat de l’enzim.

Tots aquests reactius, i també l’aigua, són indispensables per tal de dur a terme qualsevol PCR. No obstant, i depenent de les característiques de l’ADN que es vulgui amplificar, podrem afegir altres components. Aquests poden ser especials per l’amplificació de zones altament repetitives del genoma, seqüències molt llargues, o regions molt riques en un únic tipus de nucleòtid.

En termes generals, la tècnica de la PCR aprofita les característiques moleculars de la doble cadena de l’ADN i la seva desnaturalització (separació de les cadenes) o renaturalització (unió de les cadenes) segons la temperatura a la qual sotmets la mostra. Concretament, la PCR consta de tres etapes:

  • 1a etapa. Desnaturalització de la cadena d’ADN. Durant aquesta fase se separen les dues cadenes que formen la doble hèlix d’ADN. Per a realitzar aquest procés és necessari elevar la temperatura a 95ºC.
  • 2a etapa. Hibridació dels encebadors. En la fase d’hibridació, la parella d’encebadors s’uneix a la seqüència complementària de l’ADN motlle a estudiar. Per fer-ho cal baixar la temperatura a intervals d’entre 50 i 65ºC, depenent de les característiques dels encebadors utilitzats.
  • 3a etapa. Extensió o elongació de la cadena d’ADN. En aquesta fase es produeix l’extensió de noves cadenes d’ADN a partir dels encebadors gràcies a l’acció de l’ADN polimerasa. La temperatura d’aquesta fase depèn del tipus d’ADN polimerasa utilitzada. Per exemple, la Taq polimerasa sintetitza cadenes d’ADN a 72ºC. Actualment, existeixen diferents ADN polimerases comercials i totes elles són termostables, és a dir, que no es desestabilitzen degut a canvis de temperatura.

La següent figura il·lustra el procés de la PCR:

Etapes de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR)

Etapes de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). Adaptada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PCR_Steps.JPG

 

Les tres etapes anteriorment descrites formen un cicle de PCR. En un cicle es duplica la quantitat de molècules d’ADN ja que les cadenes del cicle anterior serveixen de motlle pel següent cicle. D’aquesta manera el potencial d’aquest mètode rau en el fet que la quantitat de molècules d’ADN que s’obtenen a mesura que es realitzen cicles creix exponencialment (2n) de forma que partint d’una molècula d’ADN se’n poden obtenir milions. A la pràctica habitual se solen fer uns 35-40 cicles mitjançant l’ús d’uns aparells anomenats termocicladors en els que, com el seu nom indica, es poden programar les condicions de temperatura de les diferents etapes de la reacció així com el número de cicles.

Models de termocicladors de l’empresa Thermo Fischer Scientific i Applied Biosystems.

Models de termocicladors de l’empresa Thermo Fischer Scientific i Applied Biosystems.

 

Finalment, un cop acabada la PCR, caldrà comprovar que hem obtingut el producte amplificat d’interès, que la seva mida és l’esperada i que l’amplificació ha estat específica. La tècnica de la PCR serveix com a punt de partida per moltes altres tècniques de laboratori, per això s’ha convertit en indispensable en qualsevol laboratori de biologia molecular d’arreu del món.

 




Referències

Aquest lloc web fa servir cookies pròpies i de tercers per millorar l’experiència de navegació, i oferir continguts i serveis d’interès.
En continuar la navegació entenem que s’accepta la nostra política de cookies.

Accepto